大家好，我是顶顶，关于植物组织中超氧化歧化酶活性测定，以及植物超氧化物歧化酶偏高的原因相关的一些知识点可能大家还太了解，顶顶给大家总结了一些相关知识点，现在让我们一起来看看吧！
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检测超氧化物歧化酶体外定量测定与测量活性有什么区别
检测超氧化物歧化酶体外定量测定与测量活性有什么区别
①DPPH 1-二苯基-2-三硝基苯肼植物组织中超氧化歧化酶活性测定，别名 1,1-二苯基-2-苦肼基植物组织中超氧化歧化酶活性测定，俗称自由基。DPPH有两个主要的应用，都用于实验室研究中：一是在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质，典型的用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价 植物组织中超氧化歧化酶活性测定；还可以作为电子顺磁共振信号位置和强度的标准物质。
②超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase简称SOD）是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。
③CAT（过氧化氢酶）存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不致于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH
几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。
④丙二醛（MDA）生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。脂质氧化终产物丙二醛（MDA）在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性。
MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。
酶活力的测定方法及原理
酶活力的测定方法：有两种主要方法即终止反应法和连续反应法。
终止反应法：是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。
连续反应法：无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。
酶活性测定的原理：
1. 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的测定 SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。
SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。
2. 过氧化氢酶（Catalase，CAT）
活性测定 CAT 活性参照Aebi (1984)[7]的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL 。400 μL反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 μL粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bola?os和Mercado-Silva，2004）。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。350μL反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100μmol/L邻苯二酚）中加入50 μL的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
4. 过氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。反应体系为30μL粗酶液，290 μL 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）和 80μL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）。反应在加入H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性 具体步骤
(一) 原理
·O2氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐, 后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色, 在波长530nm处有最大吸收峰, 可用分光光度法进行测定, 当SOD消除·O2后形成的亚硝酸盐减少。
(二) 仪器与试剂
1. 仪器
721分光光度计；离心机；恒温水浴；匀浆器。
2. 试剂
(1) 1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8；
(2) 10mmol/L盐酸羟胺: 盐酸羟胺6.95mg, 加水至10ml；
(3) 7.5mmol黄嘌呤: 黄嘌呤11.41mg, 加水至10ml；
(4) 0.023U/ml黄嘌呤氧化酶: 25U/0.9ml黄嘌呤氧化酶8.4μl加pH7.8磷酸盐缓冲液至10ml；
(5) 10g/L甲萘胺；3.3g/L对按基苯磺酸；3g/L磺基水杨酸；SOD标准品；
(6) 三氯甲烷；95%乙醇(V/V)。
(三) 实验步骤
1. 红细胞抽提液制备 50μl全血冲入0.5ml生理盐水, 2000r/min离心3min,弃上清, 加冰冷的双蒸水0.2ml混匀, 加入95%乙醇0.1ml, 振荡30s, 加入三氯甲烷0.1ml, 置快速混合器抽提1min。 4000r/min离心3min, 分层, 上层为SOD抽提液,中层为血红蛋白沉淀物, 下层为三氯甲烷, 记录上清液体积待测。
2. 组织匀浆的制备 剪取一定量的所需脏器, 生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎, 至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s, 间歇30s, 反复进行三次, 制成10%组织匀浆, (最好用超声波发生器处理30s), 使线粒体振破, 以中性红─詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎, 以4000r/min离心5min, 取上清液20μl待测。
3. 样品测定
4. SOD标准抑制曲线 将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/ml的溶液, 再稀释到50倍, 即SOD量为15U/ml(1.5μg/ml), 用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率, 以百分抑制率为纵坐标, 以SOD活力单位U/min为横坐标绘制标准曲线。
式中: A──对照管OD
B──测定管OD
(四) 结果计算
每ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位。
式中: A──对照管OD
B──测定管OD
V──反应液总量(ml)
N──样品稀释倍
W──取液量
也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/ml, 乘以稀释倍数(1ml/取样量)。
若样品为组织匀浆液, 根据匀浆浓度或组织蛋白质含量, 将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。
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